Investigación en bioquímica molecular y proteómica 2008
Por cuarto año consecutivo los alumnos del último año de la especialidad Química de la Escuela Técnica ORT Argentina realizarán sus proyectos finales en distintas universidades y centros de investigación con profesionales reconocidos. La metodología de trabajo evita la transpocisión didáctica permitiendo a los estudiantes realizar su actividad final en los lugares donde se está generando el conocimiento.
La articulación entre el nivel medio y el postgrado universitario es auspiciada por el CONICET (Consejo Nacional de Investigación Científica y Técnica).
Los proyectos de investigación para el año en curso son:
1) Evaluación de la expresión de la molecula de adhesión cadherina epitelial en tejidos humanos normales y tumorales.
Investigador: Dra. Mónica Vazquez-Levin.
Instituto: Instituto de Biología y Medicina Molecular (IBYME - CONICET).
Alumnos: Yael Dobzewicz Y Gala Szapiro.
Blog: http://www.proyecto-6q.blogspot.com/
2) Acción del hexaclorobenceno (HCB) sobre la uroporfirinogeno de una línea celular hepatocitos humanos. Mecanismo de acción.
Investigador: Dra. María del Carmen Ríos de Molina.
Instituto: Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Alumnos: Lucas Toiw y Uriel Frid.
Blog: http://www.proyectofrid-toiw08.blogspot.com/
3) os experimentales de enfermedades metabólicas: Porfiria y Síndrome Metabólico. Proteómica y Metabolómica de estos disturbios.
Investigador: Dra. Marta Blanca Mazzetti.
Instituto: Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA). Alumnos: Maria Duperron y Mauro Elencwajg.
Blog: http://www.proyectofinal6q.blogspot.com/
4) Factores no hemodinámicos relacionados con la génesis y evolución de la proteinuria durante la enfermedad renal progresiva.
Investigador: Dra. Elsa Zotta.
Instituto: Laboratorio de Fisiopatogénia, Departamento de fisiología, Facultad de medicina, UBA.
Alumnos: Barbara Helueni y Melanie Naiman.
Blog: http://www.proyectoq08.blogpsot.com/
5) Estudio de la participacion de la anandamida en la regulacion de la interaccion espermatozoide-ovioducto en un o bovino.
Investigador: Dra. Silvina Perez Martinez.
Instituto: Facultad de medicina - UBA.
Alumnos: Judith Arenas Tenenbaum y Melina Braverman.
Blog: http://www.scienceproject08.blogspot.com/
6) El estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la regulación del gen UGA4 de Saccharomyces cervisiae en respuesta a cambios en la disponibilidad de nutrientes con el fin de dilucidar las distintas cascadas de señales desencadenadas por dichos nutrientes y establecer sus interconexiones.
Investigador: Dra Susana Correa García.
Instituto: Departamento de Química Biologica, Facultad de ciencias Exactas y Naturales, UBA.
Alumnos: Iván Mikiej y Victoria Salama
Blog: http://www.proyectoquimica22.blogspot.com/
7) Diagnóstico de la enfermedad de Von Willebrand (VWD) tipo 2N por técnicas fenotípicas y genotípicas.
Investigador: Dra. Adriana I. Woods.
Instituto: Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex" de la Academia Nacional de Medicina.
Alumnos: Abigail Skverer y Daniela Lin
Blog: http://www.vwd-diagnostico.blogspot.com/
8) Estudio de la mielinogenesis en el sistema nervioso periferico en condiciones fisiologicas y patologicas. Participacion de celulas pluripotentes en el proceso de degeneracion-regeneracion nerviosa.
Investigador: Dra Patricia Setton-Avruj.
Instituto: Departamento de Quimica Biologica, Facultad de Farmacia y Bioquimica (IQUIFIB-UBA-CONICET).
Alumnos: Averbuj Daniel y Eitan Rozenszajn.
Blog: http://www.proyectoaverbuj-rozenszajn.blogspot.com/
9) Diseño y desarrollo de vacunas antitumorales empleando bacterias y celulas tumorales modificadas con genes inmunomodiladores. Estudio de los mecanismos inmunes inducidos.
Investigador: Claudia I. Waldner y Claudia Mongini.
Instituto: Laboratorio de inmunologia celular y molecular. Centro de Estudios Farmacologicos y Botanicos (CEFYBO. CONICET-UBA)
Alumnos: Amalia Surijon y Maria Belen Tolava Rivero.
Blog: http://www.amibeluproyecto.blogspot.com/
10) Marcadores Geneticos Asociados al Cáncer.
Investigador: Dr.Javier Hernán Cotignola.
Instituto: Laboratorio de Cáncer y Apoptosis del Departamento de Quimica Biologica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA.
Alumnos: Ayelén Marano y Solange Perchik
Blog: http://www.marcadoresgeneticos.blogspot.com/
11) Expresion del canal de la conductancia transmembranal de la Fibrosis Quistica (CFTR) en placentas Preeclampticas: posible rol en la regulacion de la actividad de la Acuoporina-9 (AQP9).
Investigador: Dr Alicia E Damiano.
Instituto: Catedra de Biologia Celular, Departamento de Ciencias Biologicas, Facultad de Farmacia y Bioquimica (UBA)
Alumnos: Gabriel Colodenco y Martín Sapir.
Blog: http://www.proyectofinalcs.blogspot.com/
12) Proteómica de factores secretados por células de cáncer de mama y mama normal con capacidad inhibitoria de la producción lipídica.
Investigador: Dra.Guerra de Grignoli Liliana Noemi.
Instituto: Departamento de Ciencias biologicas. Facultad de ciencias exactas y naturales, UBA-CONICET.
Alumnos: Fabiana Durante y Tamara Broitman.
Estas eran algunas de las ratas usadasen la investigacion de la pasantia de nuestras compañeras
Esta rata tiene una sonda por la que sepuede inyectar la toxina directamente a su cerebro
Martin Sapir y Gabriel Colodenco
Esta semana trabajamos con muestras de placentas preeclampticas y las preparamos para las centrifugaciones necesarias para extraer las vesiculas de las membranas celulares de las mismas.
Primero las rotulamos y separamos en tubos, una vez hecho esto las procesamos con el ultraturrax para romper todas las membranas posibles. Por ultimo empezamos con las centrifugaciones diferenciales que resultarian en la extraccion de las vesiculas, pero no realizamos todas porque las ultimas requieren de varias horas.
Martin Sapir Y Gabriel Colodenco
Esta semana trabajamos extrayendo cARN de dos cultivos de E.Coli. Cada uno de nosotros trabajo con uno y una vez que terminamos la extraccion lo llevamos a PCR para amplificar lo que logramos extraer. Tuvimos que trabajar con mucho cuidado ya que todo debia estar libre de rnasas que pudieran hacer fracasar la extraccion
Martin Sapir y Gabriel Colodenco
La preeclampsia, es una complicación médica del embarazo también llamada toxemia del embarazo o hipertensión inducida embarazo y asociada a elevados niveles de proteína en la orina. Debido a que la preeclampsia se refiere a un cuadro clínico o conjunto sintomático, en vez de un factor causal específico, se ha establecido que puede haber varias etiologías para el trastorno. Es posible de que exista un componente en la placenta que cause disfunción endotelial en los vasos sanguíneos maternos en mujeres susceptibles. Aunque el signo más notorio de la enfermedad es una elevada presión arterial, puede desembocar en una eclampsia, con daño al endotelio materno, riñones e hígado. La única cura es la inducción del parto, una cesárea o aborto y puede aparecer hasta seis semanas posparto. Es la complicación del embarazo más común y peligrosa, por lo que debe diagnosticarse y tratarse rápidamente, ya que en casos severos ponen en peligro la vida del feto y de la madre.
El descubrimiento de la preeclampsia se remota a hace mas de 100 años, pero aun no se ha logrado descubrir una causa puntual ni, por ende, una manera de diagnosticarla con precisión mas allá del reconocimiento de los síntomas asociados a la misma pasada la 24º semana de gestación. Dichos síntomas son:
-Hipertensión
-Proteinuria
-Edemas
Siendo la hipertensión el mas característico de dichos síntomas.
En teoría, solo se podría, en rigor, diagnosticar una preeclampsia si se observan 1) Reducción del flujo renal y uterino; 2) Reducción del filtrado glomerular; 3) Aumento de presión arterial con prueba de infusión de angiotensina; 4) Disminución de la excreción de sodio en prueba de sobrecarga; 5) Lesión glomerular típica por biopsia renal.
Aun así, el diagnostico clínico de la preeclampsia puede ser erróneo y comprender verdaderas nefropatias no reconocidas, hipertensión arterial no diagnosticada, hipertensión esencial exteriorizada durante la gestación con niveles normales en la primera mitad. Muy frecuentemente, la triada sintomática es inadvertida o despreciada por la paciente. Mas adelante, cuando se desarrollan síntomas mas alarmantes o que ellas mismas pueden detectar (cefaleas, trastornos visuales, edema palpebral y digital, etc.) el proceso suele estar avanzado y se ha perdido mucho tiempo. Por consiguiente, es obvia la importancia trascendental del control prenatal en la detección y tratamiento temprano de la patología, especialmente si se detectan factores predisponentes, ya que las formas severas son prevenibles.
Sin embargo, la posibilidad del diagnostico mediante el seguimiento del proceso de gestación no es suficiente en la lucha contra la enfermedad, ya que una falta de controles representa casi lo mismo que una ceguera a la hora del diagnosis, eso sin mencionar los sectores de bajos recursos o los sectores alejados de hospitales.
Como patología mas recurrente entre las asociadas al embarazo (afectando entre el 5% y el 10% de las mujeres que transcurren esta etapa) es indispensable el descubrimiento de una causa puntual que lleve a un diagnostico mas simple, preciso y accesible, por eso es que nos dedicamos al estudio de la AQP9, que es una proteína importante en el funcionamiento de las células y en un cuadro preeclamptico parece tener un comportamiento fuera de lo común.
Esta semana procedimos con la actividad que la semana pasada no habiamos podido realizar, es decir, la extraccion de ADN de bacterias E.Coli procedentes de una cepa no patogena.
Cada uno de nosotros recibio un pellet de bancterias E.Coli, conseguido a traves de la centrifugacion de dos alicuotas distintas de un caldo sembrado con las mismas bacterias.
A partir de eso, cada uno procedio con su pellet para poder extraer el ADN por separado, no a modo de competencia, pero para realizar los mismos pasos cada uno y poder comparar resultados.
Tambien, previo a empezar la extraccion, nos ocupamos de revelar una membrana de nitro celulosa a la que habian sido transferidas proteinas de otra corrida realizada hacia algun tiempo en la que no habiamos participado mas alla de la preparacion del gel de poliacrilamida.
Para el final de la practica, ambos dos contabamos con una varilla en la que habiamos enroscado el ADN obtenido, ya que tiene una consistencia similar a la de una mucosa.
Por ultimo, queremos mencionar que la proxima semana no habra practica debido a que ambos, Alicia y Mauricio, se tomaran la semana por vacaciones de la facultad. Sumadas nuestras vacaciones de invierno, tendremos un periodo de tres semanas de inactividad.
Martin Sapir y Gabriel Colodenco
Esta semana nos ibamos a dedicar a extraer adn de bacterias E.coli, pero como no teniamos los cultivos decidimos cambiar de practica y realizar una PCR.
Trabajamos con 4 secciones de ADNc y los preparamos para realizar la PCR, una de ellas siendo un negativo para comprobar contaminaciones y terminamos la experimentacion del dia al ponerlas en la maquina PCR nueva del laboratorio.
Martin Sapir y Gabriel Colodenco
Esta semana trabajamos con plasmidos y nos dedicamos a purificarlos mediante un proceso de varias soluciones y centrifugaciones.
Una vez los terminamos de purificar, realizamos una corrida en gel de agarosa (southern blot) para comprobar la purificacion.
Una vez terminamos la corrida, pudimos ver una sola banda brillante a la luz ultravioleta en el gel, ya que le habiamos aplicado bromuro de etidio para este proposito.
Esta unica banda por calle demuestra que la purificacion de los plasmidos fue efectiva.
Esta es la lampara UV que usamos para ver las bandas del gel
Las bandas brillantes son los plasmidos que brillanpor el bromuro de etidio; la corrida salio prolija y sin contaminaciones
Esta semana nos dedicamos a revelar la membrana de nitrocelulosa de la semana pasada y a desteñir el gel con el coomasie blue para poder dejar solamente las proteinas teñidas.
Estuvimos incubando la membrana en soluciones de bloqueo, buffers para poder enjuagarla y los anticuerpos primarios y secundarios antes de dejarla a oscuras para que se revele.
Para desteñir el gel, realizamos las soluciones necesarias y realizamos varios lavados para que de a poco el gel vuelva a su color original, dejando teñidas solamente a las proteinas en el. Como son procesos muy largos, no pudimos completar ninguno de los dos, por lo que los dejamos revelando y destiñendose respectivamente, ambos en el ultimo paso, que es hasta donde llegamos.
El gel teñido con el coomasie blueen la primera etapa de desteñido
La membrana de nitrocelulosa siendo incubadacon los anticuerpos primarios y secundarios
El gel en otra etapa de desteñido,ahora se destiño mas y se expandio un poco
Esta semana realizamos un tercer western blot, ya que los dos anteriores no tenian revelados muy claros. Por los resultados obtenidos, estaba claro que el primero habia fallado por la fuente usada, pero el segundo habia salido mal de un lado y bien del otro, por lo que concluimos que era una cuestion de la temperatura. Al parecer la fuente levantaba temperatura durante la transferencia a la membrana de nitrocelulosa y esta no se daba bien, y como poniamos hielo para mantener la temperatura, pero solo de un lado, una salio bien y la otra no. Esta vez aplicamos mucho hielo y en todos los lados de la cuba para que se realize bien la transferencia a la membrana de nitrocelulosa.
Ademas, teñimos uno de los geles con coomasie blue para poder ver todas las proteinas y tener asi un negativo, ya que el revelado de la membrana es con anticuerpos y por lo tanto es especifico.
El gel con las proteinas ya corridasmientras se tiñe con el coomasie blue
Instrucciones para purificar ARN,una de las proximas tareas que realizaremos
Esta semana trabajamos por primera vez con las muestras de placenta sin haber pasado por todas las centrifugaciones y extracciones que son realizadas en las mismas para separar las membranas que buscamos analizar. Obviamente, al no tener todavia la experiencia necesaria, trabajamos con las muestras ya tomadas en trozos de su forma original, aunque tarde o temprano trabajaremos con la placenta propiamente dicha.
Lo que debiamos hacer era separar las muestras en tubos para poder procesarlas con el turrex y dejar de esta manera, la muestra lista para su centrifugado. El turrex es un motor muy potente al que conectamos una hoja pequeña similar a la de una multiporcesadora para poder rompre la membrana placentaria en trozos muy pequeños, tanto, que se se pueden sentrifugar ordenadamente las muestras para separar los nucleos, las organelas y las membranas que nos interesan.
Estas son las muestras placentarias tras procesarlas
Este es el molde que usamos para la perparacion del gelde poliacrilamida que usamos en los western blots
Esta semana trabajamos en las hojas de nitrocelulosa a las que habian sido transferidas las proteinas de una corrida con el metodo de western blot.
Preparamos los bufferes necesarios para esto y dejamos interactuar las hojas con los mismos para llevar a cabo la revelacion. Como el bloqueo de los sitios alostericos toma 48 hs, trabajamos hasta dejar ese paso llevarse a cabo en los dias siguientes.
Tambien preparamos otros bufferes necesarios para practicas venideras y otros metodos que necesitamos realizar con frecuencia.
Ademas, como tuvimos un problema con el pH que nos parecio extraño en la preparacion de uno de los bufferes, Alicia nos explico lo que habia sucedido brevemente con un grafico.
con el buffer de striping, o sea el primero de los pasos de la practica
Esta es la gradilla que usamos para sostenerdurante la practica, nos parecio interesante
sacarle una foto
Este es el grafico que nos mostro Alicia paraMartin Sapir y Gabriel Colodenco
Estos son los alcoholes en los que rehidratamos las muestras.a otro que este mas hidratado que el anterior
Estas son las camaras siendo incubadas en la camara humedaAl llegar al laboratorio vimos los resultados de lo que habiamos realizado la semana pasada.
Al parecer, un problema con la fuente provoco una corrida irregular e ilegible, por lo que repetimos el analisis con otra fuente para que esta vez funcione bien, y a juzgar por lo que vimos en el gel de poliacrilamida, esta vez parece haber sido un exito.
Ademas de eso, realizamos una inmunohistoquimica de muestras placentarias montadas en portaobjetos y las vimos al microscopio.
Eran tres, todas habian sido tratadas en condiciones distintas el mismo tiempo, la primera solo en condiciones normales, la segunda habia sido mantenida la mitad del tiempo en hipoxia y la otra mitad en condiciones normales y la tercera solamente en hipoxia.
Pudimos apreciar los efectos que produce la hipoxia en las celulas placentarias y a partir de las condiciones en la segunda muestra, concluimos en que las celulas tienen una habilidad regenerativa, ademas observamos la localizacion de AQP9 en dichas muestras.
Por otra parte, pudimos encontrar una manera para arreglar el problema de las fotos de la semana pasada, asi que a partir de la semana que viene, podremos subir fotos para ayudarnos a explicar lo realizado.
Saludos
Martin Sapir y Gabriel Colodenco
Muy bien, empezamos el proyecto final tan esperado el jueves 15 de mayo.
En esta primera entrada, pasamos a relatar lo realizado:
Al encontrar el laboratorio de biologia celular de la facultad de farmacia y bioquimica UBA, fuimos recibidos por la investigadora Alicia Damiano y su compañero Mauricio Castro, quienes nos pasaron a contar en que se basaba la investigacion que estaban realizando.
Luego, tuvimos una explicacion sobre una de las tecnicas que mas utilizariamos en la investigacion: Western Blot, ya que nos permite el analisis de las proteinas de distintas muestras placentarias tratadas de distintas maneras.
Como era necesario para el metodo realizar una corrida en gel de poliacrilamida, el gel ya habia sido preparado por Mauricio, al igual que las muestras placentarias. Por eso, lo que nosotros hicimos fue preparar las muestras para el metodo agregandoles un buffer e hirviendolas, y una vez hecho esto, las sembramos en el gel.
Pasada la corrida en el gel, lo que hicimos fue preparar el revelado y dejarlo en proceso, ya que este requeria de 2 horas para ser completado, por lo que acabamos el dia una vez dejado el proceso en funcionamiento.
Habiamos tomado varias fotos para mostrar aqui lo realizado, pero debido a un inconveniente, no pudimos aprovecharlas. De poder resolverlo, vamos a poder empezar a documentar mejor lo realizado.
Esperamos ansiosamente al proximo jueves para poder continuar el proyecto.
Saludos
Martin Sapir y Gabriel Colodenco
