Semana 7

Esta semana nos dedicamos a revelar la membrana de nitrocelulosa de la semana pasada y a desteñir el gel con el coomasie blue para poder dejar solamente las proteinas teñidas.
Estuvimos incubando la membrana en soluciones de bloqueo, buffers para poder enjuagarla y los anticuerpos primarios y secundarios antes de dejarla a oscuras para que se revele.
Para desteñir el gel, realizamos las soluciones necesarias y realizamos varios lavados para que de a poco el gel vuelva a su color original, dejando teñidas solamente a las proteinas en el. Como son procesos muy largos, no pudimos completar ninguno de los dos, por lo que los dejamos revelando y destiñendose respectivamente, ambos en el ultimo paso, que es hasta donde llegamos.

El gel teñido con el coomasie blue
en la primera etapa de desteñido La membrana de nitrocelulosa siendo incubada
con los anticuerpos primarios y secundarios

El gel en otra etapa de desteñido,
ahora se destiño mas y se expandio un poco

Martin Sapir y Gabriel Colodenco

Semana 6

Esta semana realizamos un tercer western blot, ya que los dos anteriores no tenian revelados muy claros. Por los resultados obtenidos, estaba claro que el primero habia fallado por la fuente usada, pero el segundo habia salido mal de un lado y bien del otro, por lo que concluimos que era una cuestion de la temperatura. Al parecer la fuente levantaba temperatura durante la transferencia a la membrana de nitrocelulosa y esta no se daba bien, y como poniamos hielo para mantener la temperatura, pero solo de un lado, una salio bien y la otra no. Esta vez aplicamos mucho hielo y en todos los lados de la cuba para que se realize bien la transferencia a la membrana de nitrocelulosa.
Ademas, teñimos uno de los geles con coomasie blue para poder ver todas las proteinas y tener asi un negativo, ya que el revelado de la membrana es con anticuerpos y por lo tanto es especifico.

El gel con las proteinas ya corridas
mientras se tiñe con el coomasie blue

Instrucciones para purificar ARN,
una de las proximas tareas que realizaremos

Martin Sapir y Gabriel Colodenco

Semana 5

Esta semana trabajamos por primera vez con las muestras de placenta sin haber pasado por todas las centrifugaciones y extracciones que son realizadas en las mismas para separar las membranas que buscamos analizar. Obviamente, al no tener todavia la experiencia necesaria, trabajamos con las muestras ya tomadas en trozos de su forma original, aunque tarde o temprano trabajaremos con la placenta propiamente dicha.
Lo que debiamos hacer era separar las muestras en tubos para poder procesarlas con el turrex y dejar de esta manera, la muestra lista para su centrifugado. El turrex es un motor muy potente al que conectamos una hoja pequeña similar a la de una multiporcesadora para poder rompre la membrana placentaria en trozos muy pequeños, tanto, que se se pueden sentrifugar ordenadamente las muestras para separar los nucleos, las organelas y las membranas que nos interesan.

Ademas, preparamos el gel necesario para poder hacer un western blot, que probablemente sera la practica de la semana que viene, ya que venimos con una racha poco precisa de resultados en los western blots que realizamos en semanas anteriores.

Estas son las muestras placentarias tras procesarlas

y dejarlas listas para su almacenamiento en el congelador

Este es el molde que usamos para la perparacion del gel
de poliacrilamida que usamos en los western blots

Martin Sapir y Gabriel Colodenco

Semana 4

Esta semana trabajamos en las hojas de nitrocelulosa a las que habian sido transferidas las proteinas de una corrida con el metodo de western blot.
Preparamos los bufferes necesarios para esto y dejamos interactuar las hojas con los mismos para llevar a cabo la revelacion. Como el bloqueo de los sitios alostericos toma 48 hs, trabajamos hasta dejar ese paso llevarse a cabo en los dias siguientes.
Tambien preparamos otros bufferes necesarios para practicas venideras y otros metodos que necesitamos realizar con frecuencia.
Ademas, como tuvimos un problema con el pH que nos parecio extraño en la preparacion de uno de los bufferes, Alicia nos explico lo que habia sucedido brevemente con un grafico.

Estas son las hojas de nitrocelulosa interactuando
con el buffer de striping, o sea el primero de los pasos de la practica

Esta es la gradilla que usamos para sostener

todos los ependorffs y demas tubos que usamos
durante la practica, nos parecio interesante
sacarle una foto

Este es el grafico que nos mostro Alicia para

explicarnos lo ocurrido con el buffer durante la practica

Martin Sapir y Gabriel Colodenco