Esta semana procedimos con la actividad que la semana pasada no habiamos podido realizar, es decir, la extraccion de ADN de bacterias E.Coli procedentes de una cepa no patogena.
Cada uno de nosotros recibio un pellet de bancterias E.Coli, conseguido a traves de la centrifugacion de dos alicuotas distintas de un caldo sembrado con las mismas bacterias.
A partir de eso, cada uno procedio con su pellet para poder extraer el ADN por separado, no a modo de competencia, pero para realizar los mismos pasos cada uno y poder comparar resultados.
Tambien, previo a empezar la extraccion, nos ocupamos de revelar una membrana de nitro celulosa a la que habian sido transferidas proteinas de otra corrida realizada hacia algun tiempo en la que no habiamos participado mas alla de la preparacion del gel de poliacrilamida.
Para el final de la practica, ambos dos contabamos con una varilla en la que habiamos enroscado el ADN obtenido, ya que tiene una consistencia similar a la de una mucosa.
Por ultimo, queremos mencionar que la proxima semana no habra practica debido a que ambos, Alicia y Mauricio, se tomaran la semana por vacaciones de la facultad. Sumadas nuestras vacaciones de invierno, tendremos un periodo de tres semanas de inactividad.
Martin Sapir y Gabriel Colodenco
Esta semana nos ibamos a dedicar a extraer adn de bacterias E.coli, pero como no teniamos los cultivos decidimos cambiar de practica y realizar una PCR.
Trabajamos con 4 secciones de ADNc y los preparamos para realizar la PCR, una de ellas siendo un negativo para comprobar contaminaciones y terminamos la experimentacion del dia al ponerlas en la maquina PCR nueva del laboratorio.
Martin Sapir y Gabriel Colodenco
Esta semana trabajamos con plasmidos y nos dedicamos a purificarlos mediante un proceso de varias soluciones y centrifugaciones.
Una vez los terminamos de purificar, realizamos una corrida en gel de agarosa (southern blot) para comprobar la purificacion.
Una vez terminamos la corrida, pudimos ver una sola banda brillante a la luz ultravioleta en el gel, ya que le habiamos aplicado bromuro de etidio para este proposito.
Esta unica banda por calle demuestra que la purificacion de los plasmidos fue efectiva.
Esta es la lampara UV que usamos para ver las bandas del gel
Las bandas brillantes son los plasmidos que brillanpor el bromuro de etidio; la corrida salio prolija y sin contaminaciones
Esta semana nos dedicamos a revelar la membrana de nitrocelulosa de la semana pasada y a desteñir el gel con el coomasie blue para poder dejar solamente las proteinas teñidas.
Estuvimos incubando la membrana en soluciones de bloqueo, buffers para poder enjuagarla y los anticuerpos primarios y secundarios antes de dejarla a oscuras para que se revele.
Para desteñir el gel, realizamos las soluciones necesarias y realizamos varios lavados para que de a poco el gel vuelva a su color original, dejando teñidas solamente a las proteinas en el. Como son procesos muy largos, no pudimos completar ninguno de los dos, por lo que los dejamos revelando y destiñendose respectivamente, ambos en el ultimo paso, que es hasta donde llegamos.
El gel teñido con el coomasie blueen la primera etapa de desteñido
La membrana de nitrocelulosa siendo incubadacon los anticuerpos primarios y secundarios
El gel en otra etapa de desteñido,ahora se destiño mas y se expandio un poco
Esta semana realizamos un tercer western blot, ya que los dos anteriores no tenian revelados muy claros. Por los resultados obtenidos, estaba claro que el primero habia fallado por la fuente usada, pero el segundo habia salido mal de un lado y bien del otro, por lo que concluimos que era una cuestion de la temperatura. Al parecer la fuente levantaba temperatura durante la transferencia a la membrana de nitrocelulosa y esta no se daba bien, y como poniamos hielo para mantener la temperatura, pero solo de un lado, una salio bien y la otra no. Esta vez aplicamos mucho hielo y en todos los lados de la cuba para que se realize bien la transferencia a la membrana de nitrocelulosa.
Ademas, teñimos uno de los geles con coomasie blue para poder ver todas las proteinas y tener asi un negativo, ya que el revelado de la membrana es con anticuerpos y por lo tanto es especifico.
El gel con las proteinas ya corridasmientras se tiñe con el coomasie blue
Instrucciones para purificar ARN,una de las proximas tareas que realizaremos
Esta semana trabajamos por primera vez con las muestras de placenta sin haber pasado por todas las centrifugaciones y extracciones que son realizadas en las mismas para separar las membranas que buscamos analizar. Obviamente, al no tener todavia la experiencia necesaria, trabajamos con las muestras ya tomadas en trozos de su forma original, aunque tarde o temprano trabajaremos con la placenta propiamente dicha.
Lo que debiamos hacer era separar las muestras en tubos para poder procesarlas con el turrex y dejar de esta manera, la muestra lista para su centrifugado. El turrex es un motor muy potente al que conectamos una hoja pequeña similar a la de una multiporcesadora para poder rompre la membrana placentaria en trozos muy pequeños, tanto, que se se pueden sentrifugar ordenadamente las muestras para separar los nucleos, las organelas y las membranas que nos interesan.
Estas son las muestras placentarias tras procesarlas
Este es el molde que usamos para la perparacion del gelde poliacrilamida que usamos en los western blots
Esta semana trabajamos en las hojas de nitrocelulosa a las que habian sido transferidas las proteinas de una corrida con el metodo de western blot.
Preparamos los bufferes necesarios para esto y dejamos interactuar las hojas con los mismos para llevar a cabo la revelacion. Como el bloqueo de los sitios alostericos toma 48 hs, trabajamos hasta dejar ese paso llevarse a cabo en los dias siguientes.
Tambien preparamos otros bufferes necesarios para practicas venideras y otros metodos que necesitamos realizar con frecuencia.
Ademas, como tuvimos un problema con el pH que nos parecio extraño en la preparacion de uno de los bufferes, Alicia nos explico lo que habia sucedido brevemente con un grafico.
con el buffer de striping, o sea el primero de los pasos de la practica
Esta es la gradilla que usamos para sostenerdurante la practica, nos parecio interesante
sacarle una foto
Este es el grafico que nos mostro Alicia paraMartin Sapir y Gabriel Colodenco
